qPCR mit SYBR® Green .

 

Mit dem PrimaQUANT CYBR qPCR Master Mix können Sie Genotypsierungen mittels High-Resolution Melting Curves (HRM)  durchführen – ganz ohne Agarose-Gel.

Li, W., Matsuoka, M., Kai, M., Thapa, P., Khadge, S., Hagge, D. A., Brennan, P. J., & Vissa, V. (2012). Real-Time PCR and High-Resolution Melt Analysis for Rapid Detection of Mycobacterium leprae Drug Resistance Mutations and Strain Types. Journal of Clinical Microbiology, 50(3), 742–753. https://doi.org/10.1128/JCM.05183-11

Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., & Strapagiel, D. (2017). High Resolution Melting (HRM) for High-Throughput Genotyping—Limitations and Caveats in Practical Case Studies. International Journal of Molecular Sciences, 18(11), 2316. https://doi.org/10.3390/ijms18112316

Lefever, S., Rihani, A., Van der Meulen, J., Pattyn, F., Van Maerken, T., Van Dorpe, J., Hellemans, J., & Vandesompele, J. (2019). Cost-effective and robust genotyping using double-mismatch allele-specific quantitative PCR. Scientific Reports, 9(1), 2150. https://doi.org/10.1038/s41598-019-38581-z

Die Genotypisierung von Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) ist in genetischen Untersuchungen weit verbreitet, um die Faktoren zu bestimmen, die vererbten Merkmalen zugrunde liegen.

Baris, I., Etlik, O., Koksal, V., Ocak, Z., & Baris, S. T. (2013). SYBR green dye-based probe-free SNP genotyping: introduction of T-Plex real-time PCR assay. Analytical Biochemistry, 441(2), 225–231. https://doi.org/10.1016/j.ab.2013.07.007

Dhas, D. B. B., Ashmi, A. H., Bhat, B. V., Parija, S. C., & Banupriya, N. (2015). Modified low cost SNP genotyping technique using cycle threshold (Ct) & melting temperature (Tm) values in allele specific real-time PCR. The Indian Journal of Medical Research, 142(5), 555–562. https://doi.org/10.4103/0971-5916.171282

Pang, Y., Zhou, Y., Wang, S., Lu, J., Lu, B., He, G., Wang, L., & Zhao, Y. (2011). A novel method based on high resolution melting (HRM) analysis for MIRU-VNTR genotyping of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Microbiological Methods, 86(3), 291–297. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2011.05.016

Bai, L., Deng, Y.-M., Dodds, A. J., Milliken, S., Moore, J., & Ma, D. D. F. (2006). A SYBR green-based real-time PCR method for detection of haemopoietic chimerism in allogeneic haemopoietic stem cell transplant recipients. European Journal of Haematology, 77(5), 425–431. https://doi.org/10.1111/j.1600-0609.2006.00729.x

Weksberg, R., Hughes, S., Moldovan, L., Bassett, A. S., Chow, E. W., & Squire, J. A. (2005). A method for accurate detection of genomic microdeletions using real-time quantitative PCR. BMC Genomics, 6, 180. https://doi.org/10.1186/1471-2164-6-180

Zur Bestimmung der Expression eines Gens (Gen- oder RNA-Expression) muss zuvor die Gesamt-RNA in cDNA umgeschrieben werden.

Für die separate cDNA-Synthese ist unser  primaREVERSE RT-Kit erste Wahl.

Alternativ können Sie auch unseren primaQUANT 1STEP One-Step RT-qPCR Kit verwenden und direkt RNA in einer qPCR einsetzen.

Die Länge der Telomere eignet sich gut als Biomarker für die Zellalterung. Damit lässt sich auch die Auswirkung von Umwelteinflüssen auf Prozesse der Zellalterung untersuchen. Die qPCR ist eine schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methode zur Untersuchung von Telomerlängen.

Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., & Drury, S. (2019). Telomere length measurement by qPCR – Summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology, 99, 271–278. https://doi.org/10.1016/j.psyneuen.2018.10.005

Weitere Informationen:

Mit der Schmelzkurvenanalyse (High Resultion Melting Curve Analysis – HRM) lassen sich kleinste Änderungen im Genom wie z.B. SNP und Mutationen einfach mittels qPCR nachweisen.

Matsuda, K. (2017). PCR-Based Detection Methods for Single-Nucleotide Polymorphism or Mutation: Real-Time PCR and Its Substantial Contribution Toward Technological Refinement. Advances in Clinical Chemistry, 80, 45–72. https://doi.org/10.1016/bs.acc.2016.11.002

Simko, I. (2016). High-Resolution DNA Melting Analysis in Plant Research. Trends in Plant Science, 21(6), 528–537. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2016.01.004

Mohammad Rahimi, H., Pourhosseingholi, M. A., Yadegar, A., Mirjalali, H., & Zali, M. R. (2019). High-resolution melt curve analysis: A real-time based multipurpose approach for diagnosis and epidemiological investigations of parasitic infections. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 67, 101364. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2019.101364

Next-Generation Sequencing erfordert für optimale Ergebnisse und hohe Ausbeuten eine genaue Quantifizierung der zu sequenzierenden DNA-Library.

Solche DNA-Libraries lassen sich kostengünstig, schnell und akurat mittels qPCR quantifizieren. Durch Vermeidung unnötig langer PCR Amplifikationen lässt sich der NGS Workflow optimieren, auch Amplifikationsverzerrungen werden minimiert.

Buehler, B., Hogrefe, H. H., Scott, G., Ravi, H., Pabón-Peña, C., O’Brien, S., Formosa, R., & Happe, S. (2010). Rapid quantification of DNA libraries for next-generation sequencing. Methods (San Diego, Calif.), 50(4), S15-18. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.004

Copy-Number Varianten können mittels SYBR-Green qPCR über unterschiedliche Cq Werte nach eine Kalibration gemessen werden. Zusätzlich erlaubt die Information der Schmelzkurve eine Abschätzung, ob es SNPs innerhalb der CNVs gibt.

Loewe, R. P. (2013). Combinational usage of next generation sequencing and qPCR for the analysis of tumor samples. Methods (San Diego, Calif.), 59(1), 126–131. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.11.002

Die Diagnostik von Pathogenen kann auch mittels Analyse von Nukleinsäuren durchgeführt werden.

DNA-Pathogene (DNA Viren, Bakterien, Pilze) können mittels quantitativer PCR direkt analysiert werden. Für RNA-Pathogene (RNA Viren, z.B. SARS-COV2) ist eine Umschreibung der RNA in cDNA notwendig. Hierfür bieten wir Ihnen mit dem primaREVERSE RT-Kit ein cDNA-Synthese Kit an. Alternativ können Sie mit unserem primaQUANT 1-STEP Master Mixe cDNA-Synthese und qPCR in einem Schritt durchführen.

Durch die besonders hohe Reinheit unserer primaQUANT Master Mixe können diese zur Qualitätskontrolle eingesetzt werden, um z.B. auszuschließen, dass ein Produkt mit Nukleinsäuren oder Nukleasen kontaminiert ist.