cDNA-Synthese .

Unser primaREVERSE BASIC Reverse Transcription Kit enthält alles, was Sie für die cDNA Synthese aus aufgereinigter Gesamt-RNA benötigen.

Die verwendete proprietäre Reverse Transkriptase mit verminderter RNase-H Aktivität und erhöhter Thermostabillität garantiert eine hohe Spezifität und Ausbeute der cDNA Synthese. Mit Hilfe der mitgelieferten Oligo(dT) und Random Hexamer Primer können Sie das Protokoll sehr einfach entsprechend Ihren Erfordernissen optimieren.

Hard Facts .

Ready-to-use Komplett-Kit inkl. Primer und DNase
Geeignet für Templates bis 17 kb
Hohe Ausbeute durch reduzierte RNase-H Aktivität
Komplette Reverse Transkription in unter 10 Minuten
Für spezifische Primer, Random Hexamere oder Oligo(dT) Primer
Für komplexe Transkripte RT bis 65°C möglich

Anwendungen .

cDNA-Synthese

Schnelle und einfache cDNA-Synthese mit nur einem Kit. Das primaREVERSE RT-Kit bietet eine hohe Sensitivität und Spezifität. Zudem ist es sehr flexibel und liefert sowohl mit Oligo(dT) als auch Random Hexameren oder genspezifischen Primern hohe Ausbeuten.

Genexpressionsanalyse

Genexpressionslevels in Geweben oder unterschiedlichen Zelltypen lassen sich über die Detektion von spezifischer mRNA bestimmen. Dazu wird die Gesamt-RNA zuerst in cDNA umgeschrieben. In der nachfolgenden qPCR mit genspezifischen Primern bestimmt man das jeweilige Expressionslevel.

cDNA Sequencing (Diagnostik)

Im Rahmen der Diagnostik von RNA-Viren wird eine Reverse Transcription der Sequenzierung vorgeschaltet, um eine cDNA Library zu erstellen. Neben der Pathogendetektion selbst lassen sich damit auch Mutationsprofile von Pathogenen erstellen.

RNA-seq

Als Teil eines RNA-seq Workflows kann die mRNA-Anreicherung mittels Reverser Transkription in Verbindung mit Oligo(dT) Primern durchgeführt werden. Dadurch können sowohl mRNA Selektion und RT in einem Schritt durchgeführt werden, was insbesondere bei geringen RNA Mengen sinnvoll ist. Zu beachten ist, dass hierbei ein 3′-Bias bei der späteren Sequenzierung auftreten kann. Die Folge wäre eine erhöhte Anzahl an Reads für das 3′ Ende der RNAs.

Die Features .

Einfacher Workflow für maximale cDNA Ausbeute .

Mit dem primaREVERSE RT-Kit können Sie RNA in weniger als 15 Minuten in cDNA umschreiben.

Dabei müssen Sie nicht auf Eis pipettieren, da der enthaltene RNase Inhibitor den Abbau der Gesamt-RNA verhindert.

Inhalt .

Inhalt des Kits:

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Komponente	Konzentration

10x DNase Incubation Buffer	10x
DNase Enzyme Mix	5 U/µl
Reverse Transcriptase	200 U/µl
5x Reaction Buffer	5x
dNTP Mix	10 mM
Oligo-(dT)20 Primer	100 µM
Random Hexamer Primer	100 µM
RNase Inhibitor	40 U/µl
RNase-free water	–

Abpackungen des Kits:

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Artikelnummer	Verkaufseinheit
SL-9540-100	100 Reaktionen (20 µl)
SL-9540-1000	1000 Reaktionen (20 µl)

Sensitiv bis zu geringsten RNA Mengen .

Das primaREVERSE Reverse Transcription Kit ermöglicht die cDNA-Synthese selbst aus Proben mit geringsten RNA Mengen.

Von RNA zu cDNA in weniger als 15 Minuten .

Das primaREVERSE RT Kit erlaubt eine Umschreibung von RNA zu cDNA in weniger als 15 Minuten – bei voller Performance.

Mit unserer proprietären Ultra-Fast Reverse Transcriptase lässt sich die cDNA-Synthese sogar auf nur 1 Minute verkürzen, bei nur minimal reduzierter Performance.

Für komplexe Transkripte kann die Reverse Transkription auf bis zu 60 Minuten verlängert werden.

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Workflow	DNAse Treatment (optional)	Primer and Template Pre-Incubation	Reverse Transcription	Inactivation	Total Protocol Time

Ultra-Fast Workflow without gDNA Removal	–	–	1 min	2 min	3 min
Fast Workflow without gDNA Removal	–	–	5 min	2 min	7 min
Recommended Standard Workflow without gDNA Removal	–	–	10 min	2 min	12 min
Recommended Standard Workflow with gDNA Removal	5 min	–	10 min	2 min	17 min
Extended Protocol without gDNA Removal	–	5 min	10 min	2 min	17 min
Extended Protocol with gDNA Removal	5 min	5min	10 min	2 min	22 min

Primer inklusive .

Das primaREVERSE RT-Kit enthält Random Hexamer und OligoDT(20) Primer, so dass Sie die beste Wahl für Ihren Assay treffen können.

In vielen Fällen erzielen Sie mit einer 1:1 Mischung aus Random Hexamer und OligoDT(20) Primer oder Random Hexamer Primern alleine die besten Ergebnisse. In manchen Assays kann es jedoch auch sinnvoll sein, OligoDT(20) Primer zu nutzen, die am Poly-A Tail der mRNA binden.

Auch zur Verwendung Gen-spezifischer Primer ist das primaREVERSE RT-Kit hervorragend geeignet. Details dazu finden Sie im Manual.

Welchen Primer soll ich verwenden ?

Für die meisten Assays empfehlen wir entweder die Verwendung einer 1:1 Mischung aus Random Hexamer und OligoDT(20) Primer oder Random Hexamer Primer alleine.

gDNA Removal für genauere Target-Identifizierung .

Das primaREVERSE RT-Kit enthält einen DNase-Enzym-Mix zur Entfernung von genomischer DNA.

Die Entfernung genomischer DNA aus der Gesamt-RNA empfiehlt sich generell, da selbst Primer, die nicht auf genomischer DNA binden, ein Signal in der qPCR erzeugen können, siehe nachfolgende Abbildung.

RT Kit Verkaufsunterlagen DNaseTreatment Curve

Abbildung 1:

qPCR Kurvenverlauf für GAPDH mit RNA-spezifischen Primern und einer Inputmenge von 1000 ng Gesamt-RNA. Ohne DNase-Verdau führt die noch in der Probe vorhandene genomische DNA zu einem Amplifikationssignal.
Mit DNase-Verdau kann eine unerwünschte Amplifikation verhindert werden.

RT Kit Verkaufsunterlagen DNaseTreatment Cq

Abbildung 2:

qPCR Ergebnisse (Cq-Werte) mit RNA-spezifischen Primern und einer Inputmenge von 10 ng Gesamt-RNA. Die Reverse Transkription wurde mit OligoDT bzw. Random Hexamer Primern durchgeführt.

Ohne DNase-Verdau wird das qPCR Signal verfälscht. Die Genexpression erscheint höher, als sie tatsächlich ist.

Made in Germany .

Unsere Enzyme und Master Mixe entwickeln und produzieren wir ausschließlich selbst in Deutschland. Davon profitieren Sie gleich mehrfach:

Reverse Transcription Kit .

Keine Produkte gefunden!

Downloads .

Manuals

Flyer

Standard Protokoll

Erweitertes Protokoll

Manuals

Flyer

Standard Protokoll

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Komponente	Stock Konzentration	20 µl Reaktion	Finale Konzentration
RNA Template	–	10 μl	Total RNA: 10 pg bis 5 μg je Reaktion
			Aufgereinigte mRNA: 10 pg bis 500 ng je Reaktion
Primer**	100 µM	1 µl	5 µM ; Gen-spezifischer Primer: 500 nM *
5x Reaktionspuffer	5x	4 µl	1x
dNTP Mix	10 mM	1 µl	500 µM
RNAse Inhibitor (optional)	40 U/µl	0,5 µl	1 U/µl
Reverse Transcriptase	200 U/µl	1 µl	10 U/µl
RNAse freies Wasser	–	auf 20 µl	–

Inkubation bei 50-55°C für 1-10 min.
Optional: Hitzeinaktivierung bei 95°C für 2 min.

* Total RNA: 10 pg – 5 μg; purified mRNA: 10 pg – 500 ng; Sample from DNase Digestion Step
** either Oligo(dT)20, Random Hexamer or 1:1 mix of Oligo(dT)20 and Random Hexamer Primer
*** For Gene-Specific Primers we recommend to use 500 nM final primer concentration

Erweitertes Protokoll

Primer/RNA Mix

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Komponente	Stock Konzentration	11 µl Primer/RNA Mix	Finale Konzentration
RNA Template oder Sample aus gDNA Removal Schritt*	–	bis 10 µl	Total RNA: 10 pg bis 5 μg je Reaktion
			Aufgereinigte mRNA: 10 pg bis 500 ng je Reaktion
Primer**	100 µM	1 µl	5 µM; Gene-Specific Primer: 500 nM*
RNAse-freies Wasser	–	auf 11 µl	–
Primer Annealing: Inkubation bei 70°C für 5 min.

Final Reaction Mix

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Komponente	Stock Konzentration	9 µl Reaction Mix	Finale Konzentration in Reaktion (20 µl)
5x Reaktionspuffer	5x	4 µl	1x
dNTP Mix	10 mM	1 µl	500 µM
RNase Inhibitor (optional)	40 U/µl	0,5 µl	1 U/µl
Reverse Transcriptase	200 U/µl	1 µl	10 U/µl
RNase-freies Wasser	–	auf 9 µl	–
9 µl des Reaction Mix mit 11 µl Primer/RNA Mix nach Inkubation mischen
Inkubation bei 50-55°C für 1-10 min.
Optional: Hitzeinaktivierung bei 95°C für 2 min.

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Steinbrenner Laborsysteme GmbH